VEGA 2/0086/17

Luminálna regulácia srdcového ryanodínového receptora  a jej molekulárne mechanizmy      

Vedúca projektu: Marta Gaburjáková

Trvanie: január 2017 – december 2019
Koordinujúca organizácia: Centrum biovied – Ústav molekulárnej fyziológie a genetiky SAV, Bratislava

Anotácia:

Ryanodínový receptor typu 2 (RYR2) hrá nezastupiteľnú úlohu v procese spriahnutia excitácie s kontrakciou v srdcovom svale. Fyziologicky relevantná Ca regulácia RYR2 kanála je majoritne determinovaná jeho objemnou cytozolickou doménou, na ktorú sa priamo viaže cytozolický Ca2+.  Menej popísaná je luminálna Ca2+ regulácia, ktorá môže byť sprostredkovaná dvomi mechanizmami: 1. väzbou luminálneho Ca2+ priamo na luminálnej strane RYR2 kanála a 2. väzbou luminálneho Ca2+, ktorý pretečie cez otvorený RYR2 kanál, na cytozolickú doménu. Našim cieľom je preskúmať vzájomný vzťah týchto dvoch mechanizmov luminálnej regulácie. Najnovšie poznatky o štruktúre Ca2+ väzbových miest na RYR2 kanáli, nám umožňujú využitie neštandardných experimentálnych podmienok. Predpokladáme, že trojmocné katióny a ich interakcia s RYR2 kanálom významnou mierou prispejú k zosúladeniu doteraz kontroverzných výsledkov a prinesú komplexný pohľad na Ca2+ reguláciu RYR2 kanála, ktorá je v mnohých aspektoch implikovaná v ochoreniach srdca.

Kľúčové slová:

RYR2 kanál, luminálny Ca2+, cytosolický Ca2+, väzbové Ca2+ miesta, trivalentné katióny

Ciele:

Hlavným cieľom nášho projektu je získanie nových informácií o luminálnej regulácii RYR2 kanála použitím trojmocných katiónov, ktoré by nám zásadným spôsobom umožnili pochopiť detaily molekulárneho mechanizmu tohto procesu. Ako hlavný experimentálny prístup využijeme metódu rekonštitúcie iónového kanála v planárnej lipidovej membráne. Táto metóda nám umožňuje detailne skúmať funkčné vlastnosti individuálnych iónových kanálov. Ako prvé určíme vhodné zloženie experimentálnych roztokov vhľadom na to, že trojmocné katióny silno interagujú so štandardne používanými chelátormi Ca2+, pričom tieto interakcie neboli kvantitatívne popísané na dostatočnej úrovni. Je potrebné sa vyhnúť intereferencii vo funkčných efektoch, ktoré by tak mohli byť nekorektne interpretované. Ťažiskom našej práce budú elektrofyziologické experimenty, kedy použitím dvoch typov trojmocných katiónov s rozdielnym polomerom (Eu3+ a Yb3+) vyblokujeme Ca2+ väzbové miesta najskôr na luminálnej a potom na cytozolickej strane RYR2 kanála a budeme skúmať efekt luminálneho Ca2+ na aktiváciu kanála v širokom spektre experimentálnych podmienok, ktoré pokrývajú aj fyziologicky relevantnú oblasť. Na základe detailného a systematického porovnania získaných výsledkov s doteraz publikovanými dátami pre intaktnú reguláciu RYR2 kanála  určíme, ktorý z navrhnutých mechanizmov luminálnej regulácie je dominantný, resp. či navzájom interferujú alebo kompetujú. Našim cieľom nie je len čisto biofyzikálny prístup, ale našou snahou bude aj posúdenie fyziologickej relevancie jednotlivých mechanizmov v experimentálnych podmienkach, ktoré budú simulovať iónové podmienky v srdcovej svalovej bunke.

Publikácie: