VEGA 2/0107/16

Nové spôsoby regulácie N-typu (CaV2.2) vápnikových kanálov        

Vedúca projektu: Ľubica Lacinová

Trvanie: január 2016 – december 2018
Koordinujúca organizácia: Centrum biovied – Ústav molekulárnej fyziológie a genetiky SAV, Bratislava

Anotácia:

Chronická a neuropatická bolesť predstavujú závažný klinický, spoločenský a ekonomický problém. Na ich vzniku sa podieľa prenos nervových signálov sprostredkovaný vápnikovými kanálmi N-typu, alebo CaV2.2. Dnes je k dispozícii iba jeden liek, ktorý účinkuje priamo na CaV2.2 kanál, Ziconotide. Podáva sa intratekálne, na liek podávaný perorálne stále čakáme. Iónové kanály sú modulované mnohými ďalšími proteínmi, takže potenciálne lieky by nemuseli pôsobiť priamo na kanál, ale mohli by buďto stabilizovať alebo narušovať tieto interakcie. V našom projekte sa zameriame na proteíny RTN1, SLC38A1, Ptgds, TMEM 223 a Grina. Kvasinkový dvojhybridný systém ukázal, že tieto proteíny interagujú s CaV2.2 kanálmi. Je o nich známe, že sa nachádzajú najmä alebo výlučne v neurónoch a podieľajú sa na rôznych neuromodulačných procesoch. Preto sa domnievame, že môžu regulovať aj činnosť CaV2.2 kanálov. Našim cieľom je popísať funkčné mechanizmy tejto regulácie a identifikovať signalizačné dráhy, ktoré reguláciu sprostredkujú.

Kľúčové slová:

vápnikové kanály N-typu, vnútrobunkový vápnik, neuronálna excitabilita, chronická bolesť, interaktóm, dvojpórové kanály

Ciele:

Hlavným cieľom projektu je popis mechanizmov modulácie neuronálnych vápnikových kanálov CaV2.2 typu piatimi proteínmi: RTN1, SLC38A1, Ptgds, TMEM 223 a Grina, ktoré boli identifikované ako proteíny interagujúce priamo s CaV2.2 kanálom. Na identifikáciu bol použitý kvasinkový dvojhybridný systém modifikovaný tak, aby umožnil detekovať interakciu proteínov zabudovaných do bunkovej membrány. Zameriame sa na tri aspekty interaktómu CaV2.2 kanálov:

    1. Regulácia napäťovo- a časovo-závislých vlastností samotného CaV2.2 kanála

Hlavnou funkciou CaV2.2 kanálov je zabezpečiť masívny, ale veľmi presne časovaný vtok vápnika do presynaptických neurónov a naštartovať tak uvoľnenie neurotransmiterov. Už malé zmeny vrátkovania môžu vyvolať signifikantné zmeny synaptického prenosu. Preto porovnáme napäťovú závislosť a kinetiku aktivácie a inaktivácie kanálov a rozsah a kinetiku kumulatívnej inaktivácie vyvolanej vysokofrekvenčnou sériou depolarizačných pulzov alebo pulzov v tvare akčného potenciálu v prítomnosti a neprítomnosti každého zo spomenutých piatich proteínov. Vyhodnotíme aj zmeny pravdepodobnosti otvorenia kanála z pomeru maximálneho vstupného a maximálneho vrátkovacieho prúdu.

    2. Modulácia vnútrobunkových signalizačných dráh

Zistíme, či skúmané proteíny ovplyvňujú reguláciu CaV2.2 kanálov vnútrobunkovými sekundárnymi poslami vrátane G-proteínov.

    3. Regulácia endolyzozomálnych dvojpórových kanálov (DPK), ktorá môže byť sekundárnymi poslami prepojená s plazmatickými CAV2.2 kanálmi

DPK sú vnútrobunkové katiónové kanály, ktorých aktivita závisí aj od vstupu vápnika do bunky cez plazmatickú membránu. Keďže nie sú prístupné pre obvyklé merania metódou „patch clamp“, o ich regulácii máme iba minimum informácií. Preto použijeme chimérické kanály skonštruované z častí CaV3.1 kanála a z DPK transfekované v HEK 293 bunkách ako modelový systém na určenie ich elektrofyziologických vlastností ako sú napäťová závislosť a kinetika aktivácie a inaktivácie. Model využijeme aj na definovanie iónovej selektivity DPK.

Publikácie:

image Ondacova K, Karmazinova M, Lazniewska J, Weiss N, Lacinova L (2016): Modulation of Cav3.2 T-type calcium channel permeability by asparagine-linked glycosylation. Channels 10:175-184.