VEGA 2/0033/11

Faktory determinujúce spriahnuté vrátkovanie ryanodínových receptorov v srdci    

//

Vedúca projektu: Marta Gaburjáková

Trvanie: január 2011 – december 2013
Koordinujúca organizácia: Ústav molekulárnej fyziológie a genetiky SAV, Bratislava

Anotácia:

Kontrakcia srdcových buniek sa spúšťa vtokom malého množstva Ca2+ do bunky, čo následne vyvolá otvorenie ryanodínových receptorov (RyR) a masívny výtok Ca2+ z vnútrobunkových zásob. Tento proces je regulovaný pozitívnou spätnou väzbou, pretože uvoľnený Ca2+ môže vyvolať ďalší výtok Ca2+. Aby sa zabezpečila rytmická činnosť srdca musí existovať mechanizmus terminácie výtoku Ca2+. Jeden z kandidátov je spriahnuté vrátkovanie, ktoré sa prejavuje kooperatívnym fungovaním viacerých RyR kanálov. Simultánne zatvorenie všetkých RyR kanálov vo funkčnej jednotke by narušilo pozitívnu spätnú väzbu a viedlo k zastaveniu výtoku Ca2+. Cieľom našej práce je identifikovať faktory determinujúce spriahnuté vrátkovanie RyR kanálov, čím by sme chceli prispieť k pochopeniu princípov medzi-kanálovej komunikácie. Použijeme metódu rekonštitúcie iónového kanála v planárnej lipidovej membráne, ktorá umožňuje skúmať detailné funkčné vlastnosti iónového kanála snímaním elektrického prúdu,  ktorý prechádza cez vodivý pór kanála.

Kľúčové slová:

spriahnuté vrátkovanie, ryanodínový receptor, konformačná zmena, planárna lipidová membrána

Ciele:

Hlavným cieľom našej práce je preskúmať do akej miery vybrané špecifické faktory determinujú spriahnuté vrátkovanie RyR kanálov v srdci. Ako hlavný experimentálny prístup využijeme metódu rekonštitúcie iónového kanála v planárnej lipidovej membráne. Táto metóda nám umožňuje skúmať detailné funkčné vlastnosti individuálnych iónových kanálov. V prvom rade sa pokúsime zvýšiť efektivitu rekonštitúcie kooperatívne vrátkujúcich RyR kanálov izolovaných zo srdca potkana. Navrhneme modifikácie izolačného protokolu na získanie srdcových mikrozómov s RyR kanálmi, aby sme zachovali fyzické spojenie medzi RyR kanálmi v  najväčšej možnej miere. Ďalej otestujeme vplyv iónovej sily roztokov, teploty roztokov a lipidného zloženia planárnych lipidových membrán na jav spriahnutého vrátkovania. Zaujíma nás, či  experimentálne dokázaný deštruktívny efekt vysokej iónovej sily počas izolácie srdcových mikrozómov je reverzibilný. S ohľadom na proteín-lipidové interakcie, budeme skúmať, ako náboj lipidov modifikuje komunikáciu medzi kanálmi. V ďalšom sa sústredíme na detailnejší popis efektu luminálneho Ca2+ na funkčnú kooperativitu medzi RyR kanálmi. Samostatne preskúmame vplyv toku Ca2+ cez kanál a väzby Ca2+ na luminálnej strane RyR kanála. Potom sa pokúsime zaznamenať prúd cez kooperatívne vrátkujúce RyR kanály pri fyziologických podmienkach vzhľadom na luminálny Ca2+. Navrhneme experimentálne podmienky, pri ktorých bude možné zaznamenať malé prúdy Ca2+ z lumenu do cytosolu v prítomnosti 1 mM luminálneho Ca2+. Nepoužijeme zmesi Ca2+ s inými iónom ako prenášačov náboja, aby sme sa vyhli potenciálnemu kompetičnému efektu iónov na luminálnej strane kanála alebo vo vnútri póru kanála.

Publikácie:

// >
// ]]>

image Tencerová B, Zahradníková A, Gaburjáková J, and Gaburjáková M (2012): Luminal Ca2+ controls activation of the cardiac ryanodine receptor by ATP. J Gen Physiol 140:93-108.
image Gaburjakova M, Bal NC, Gaburjakova J, Periasamy M (2013): Functional interaction between calsequestrin and ryanodine receptor in the heart. Cell Mol Life Sci 70: 2935-2945.
image Gaburjakova J, Gaburjakova M (2014): Coupled gating modifies the regulation of cardiac ryanodine receptors by luminal Ca2+. Biochim Biophys Acta – Biomembranes 1838:867-873.