VEGA 2/0011/18

Regulácia srdcového ryanodínového receptora fosforylovaného proteín kinázou A      

Vedúca projektu: Jana Gaburjáková

Trvanie: január 2018 – december 2020
Koordinujúca organizácia: Centrum biovied – Ústav molekulárnej fyziológie a genetiky SAV, Bratislava

Anotácia:

Srdcový ryanodínový receptor (RYR2) je iónový kanál, ktorý z vnútrobunkových zásobníkov uvoľňuje Ca2+ ióny, pričom takto uvoľnený Ca2+ je nevyhnutný na kontrakciu srdcového svalu. Počas fyzického cvičenia a emočného stresu sa na plazmatickej membráne srdcových buniek aktivujú beta-adrenergné receptory, čím sa spúšťa vlna fosforylačných procesov zasahujúcich aj RYR2 kanál. Fosforylácia RYR2 kanála v jeho fosforylačnej doméne, kde sú lokalizované známe fosfomiesta Ser-2808 a Ser-2814, sa zabezpečuje aj činnosťou proteín kinázy A (PKA). Preskúmame ako fosforylácia vynútená in vitro iba endogénnou PKA ovplyvňuje reguláciu RYR2 kanála fyziologicky relevantnými ligandmi (Ca2+, Mg2+, ATP) a antiarytmikom flecainidom. Ďalej preštudujeme časový vývoj účinku PKA vo fosforylačnej doméne RYR2 kanála a posúdime význam bazálnej hladiny fosforylácie pre funkciu kanála. Experimentálny prístup rozšírime o bioinformatický, ktorým sa pokúsime na RYR2 kanáli lokalizovať aj ďalšie miesta a oblasti vhodné pre PKA fosforyláciu.

Kľúčové slová:

ryanodínový receptor, fosforylácia, PKA, kalsequestrín, flecainid

Ciele:

V kontrakcii kardiomyocytu zohráva nezastupiteľnú úlohu ryanodínový receptor (RYR2) lokalizovaný v membráne sarkoplazmatického retikula (SR), ktorý sa počas beta-adrenergnej stimulácie fosforyluje účinkom kináz. Hlavným cieľom projektu je komplexnejšie zhodnotiť efekt fosforylácie RYR2 kanála na funkčnej úrovni použitím metódy zabudovania iónového kanála do planárnej lipidovej membrány. Fosforyláciu RYR2 kanála vynútime iba aktiváciou endogénnej PKA kinázy a preskúmame cytoplazmatickú aj luminálnu reguláciu takto fosforylovaného kanála fyziologickými ligandmi (Ca2+, Mg2+, ATP). Keďže sa počas beta-adrenergnej stimulácie modifikuje aj luminálny priestor SR, zaujíma nás, či fosforylácia nezmení interakciu medzi RYR2 kanálom a s kanálom asociovaným kalsequestrínom (CSQ2), ktorý reguluje kinetiku Ca2+ v SR. Práve narušená komunikácia medzi týmito dvomi proteínmi v dôsledku bodových mutácii na jednom z nich môže byť jednou z príčin geneticky podmieného ochorenia srdca pre ktoré sú typické komorové arytmie objavujúce sa iba počas beta-adrenergnej stimulácie (CPVT syndróm). Otestujeme efekt perspektívneho lieku flecainidu pre liečbu CPVT syndrómu v podmienkach mimikujúcich beta-adrenergnú stimuláciu (PKA fosforylovaný RYR2 kanál+zvýšený luminálny Ca2+). V proteínoch majú fosfomiesta tendenciu lokalizovať sa blízko k sebe, aby mohli byť fosforylované tým istým proteínom kinázy avšak s časovým oneskorením. Ser-2808 na RYR2 kanáli je fosforylovaný PKA, pričom Ser-2814 je dostatočne blízko na to, aby bol obsluhovaný tou istou PKA. Preto posúdime, ako sa s časom vyvíja PKA fosforylácia oboch blízkych miest použitím fosfošpecifických protilátok a preštudujeme vplyv nasycovania fosforylácie na vlastnosti RYR2 kanála. Posúdime aj význam pokojovej hladiny fosforylácie RYR2 kanála, ktorá nesúvisí s beta-adrenergnou stimuláciou, pričom využijeme postup kompletnej defosforylácie kanálového proteínu a bioinformatika nám pomôže pri identifikácii ďalších potenciálnych fosforylačných miest a domén v RYR2 kanáli.

Publikácie:

image Gaburjakova J., Gaburjakova M.(2018):Reconstitution of Ion Channels in Planar Lipid Bilayers: New Approaches. V Advances in Biomembranes and Lipid Self-Assembly, Volume 27, Iglič A., Rappolt M. a Garcia Sáez A.J. (Eds.), Elsevier-Academic Press, str. 147-185, ISBN: 978-0-12-815772-5.