VEGA 2/0003/14

Úloha kalsequestrínu v luminálnej regulácii ryanodínového receptora v srdci        

//

Vedúca projektu: Marta Gaburjáková

Trvanie: január 2014 – december 2016
Koordinujúca organizácia: Centrum biovied – Ústav molekulárnej fyziológie a genetiky SAV, Bratislava

Anotácia:

Kontrakcia srdcových svalových buniek nastáva po masívnom uvoľnení Ca2+ z cisterien sarkoplazmatického retikula (SR) cez aktivované ryanodínové receptory (RYR2), ktoré pracujú ako  Ca2+ kanály. Hlavným fyziologickým aktivátorom RYR2 kanálov je Ca2+, ktorý sa naväzuje na objemnú cytozolickú doménu. Dôležitú úlohu však zohráva aj luminálna regulácia, ktorá je sprostredkovaná väzbou Ca2+ na minoritnú luminálnu časť RYR2 kanála. Doterajší výskum naznačuje, že kalsequestrín (CSQ2) ako hlavný Ca2+ viažúci proteín v SR by mohol plniť  úlohu Ca2+ senzora pre RYR2 kanál. Túto hypotézu podporuje aj blízka lokalizácia týchto proteínov v bunke, čo vedie k vytvoreniu objemného kanálového komplexu. Našim cieľom je systematické preskúmanie úlohy CSQ2 v luminálnej regulácii RYR2 kanála spojením elektrofyziologického a biochemického prístupu, čím by sme chceli prispieť k detailnému pochopeniu molekulárneho mechanizmu funkčnej komunikácie medzi CSQ2 a RYR2 kanálom z biofyzikálneho ako aj fyziologického hľadiska.

Kľúčové slová:

RYR2 kanál, kalsequestrín, luminálny Ca2+, planárna lipidová membrána

Ciele:

Hlavným cieľom našej práce je systematicky preskúmať  úlohu CSQ2 v luminálnej regulácii RYR2 kanála v srdci a zároveň definovať jej fyziologickú relevanciu. Ako hlavný experimentálny prístup využijeme metódu rekonštitúcie iónového kanála v planárnej lipidovej membráne. Táto metóda nám umožňuje skúmať detailné funkčné vlastnosti individuálnych iónových kanálov. V prvom rade otestujeme koncentračnú a časovú závislosť vplyvu Ca2+ a iónovej sily roztokov na interakciu CSQ2 a RYR2 kanála použitím biochemickej metódy bodového blotovania. Našim cieľom je nájsť efektívnu a účinnú metódu na odseparovanie endogénneho CSQ2 z  kanálového komplexu v našich experimentálnych podmienkach. Takto získame mikrozomálnu vzorku bez CSQ2, na ktorej preskúmame luminálnu reguláciu RYR2 kanála, ktorá nie je sprostredkovaná CSQ2. Tento set experimentov bude slúžiť ako kontrola pre ďalšie dva sety meraní, kde preskúmame vplyv endogénneho a rekombinovaného CSQ2 na luminálnu reguláciu RYR2 kanála v širokom spektre experimentálnych podmienok, ktoré pokrývajú aj fyziologicky relevantnú oblasť. Komplexné porovnanie získaných výsledkov nám poskytne ďalšie informácie o funkčnej interakcii CSQ2 a RYR2 kanála, ktoré nám môžu pomôcť objasniť úlohu luminálnej regulácie RYR2 kanála v rozvoji závažných srdcových arytmií. Naše výsledky porovnáme s už doteraz publikovanými dátami, ktoré však boli získané v prítomnosti Cs+ iónu ako prídavného prenášača náboja cez kanál. Na základe viacerých publikovaných štúdií sa domnievame, že Cs+ ión má inhibičný efekt na RYR2 kanál, čo pravdepodobne viedlo k nesprávnej interpretácií výsledkov a efekt Cs+ bol mylne pripísaný účinku CSQ2. Naše výsledky využijeme aj na otestovanie tejto hypotézy.

Publikácie:

// >
// ]]>

image Gaburjakova J, Gaburjakova M (2016): Cardiac ryanodine receptor: Selectivity for alkaline earth metal cations points to the EF-hand nature of luminal binding sites. Bioelectrochemistry 109:49-56.
image Gaburjakova M, Gaburjakova J (2017): Insights towards the identification of cytosolic Ca2+-binding sites in ryanodine receptors from skeletal and cardiac muscle. Acta Physiol 219:757-767.